GS0038_测序反应纯化试剂盒（含简易说明）GsPure Sanger Sequencing BigDye Removal Kit
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96孔PCR板操作流程（简易操作流程）
【该操作流程可以手工也可以机器，最终的生产流程，可以在熟练后自己缩短操作时间】
1、从4℃冰箱中取出GsPure Seq-RBD beads，充分混匀。
注：（1）在盖紧盖子后，一定要充分重悬浮磁珠，不能有结块磁珠出现；（2）使用完毕后放回2-8ºC冰箱保存。
2、从PCR仪器上取下反应结束的96孔PCR板，瞬时离心，将管壁的液滴离心至管底。
3、5μl的PCR反应体系中加入5μl磁珠（GsPure Seq-RBD beads）、21μl 85%乙醇（密封专用），封膜后振荡混匀，或者用移液器吹打混匀。如果是其他PCR反应体系，可参考如下表格进行加样：
体系
85%无水乙醇用量
5μl
21μl
10μl
42μl
注：（1）85%乙醇一定要配准，可用酒精计测量。强烈不建议用简单的量筒称量体积配制，因为量筒的精确度因厂家不同误差很大。因为不同的无水乙醇浓度不一样、不同的量筒的精度也不一样。如果实在没有酒精计，可按照如下方式配置，小范围实验后再扩大。500ml 85%（V/V）体积比的无水乙醇配制方法，用天平称取
无水乙醇500ml x 85% x 0.790g/ml(室温密度)=335.75g；水 500ml x 15% x 1.0g/ml(室温密度)=75g将二者混匀即可。（由于不同的乙醇密度有稍微差异、水的密度也因温度略有差异，该方法仅供参考）
（2）85%无水乙醇使用完毕后要及时盖紧盖子，避免高浓度乙醇的挥发。建议每次配制的乙醇最好不超过7天。
4、静置5 min，期间混匀1~2次，然后将PCR板置于磁力架上吸附2~5分钟，去上清。
注：静置期间一定要混匀1~2次，如果是机器自动化吹打混匀，吹打8~10次就可以；如果是手动振荡混匀，建议振荡30秒一次，混匀1~2次。
5、保持PCR板置于磁力架上，加入50μl 85% 乙醇，静置60s，去上清；
6、重复步骤5一次，最后保持PCR板在磁力架上，用吸水纸盖住板孔尽量甩干孔内液滴，或者用移液器吸干剩余的乙醇液滴。
7、保持PCR板在磁力架上，置于烘箱60℃倒置2 min，正放3 min，让乙醇彻底挥发；或者室温静置10分钟，让乙醇挥发干净。
注：该步骤一定要保证乙醇挥发干净，否则后续会出现干扰峰。
8、加25~30μl去离子无菌水封膜振荡混匀，使磁珠溶解分散，对于个别难以分散的磁珠样品，用20μl移液器反复吸打至磁珠充分混匀，瞬时离心后室温静置5 min；
注：一定是去离子的无菌水，如果含有电离子，后续上机电泳信号值会根据电离子的多少降低至无测序信号。
9、磁力架上吸附5min，用10μl排枪小心转移10μl上清液至新96孔板上，避免吸入磁珠，吸附时保持PCR板在磁力架上，上机电泳测序
注：（1）如果是多板连续上机，为避免水的挥发导致不能吸样品，可以直接转移15μl上样。这样能避免跑最后一板的时候由于挥发产生不能吸样的问题。（2）如果电泳后，出现测序的信号比较强，可以直接在对应的孔中去离子水稀释，重新电泳就可以。这个问题，在由传统的乙醇沉淀、HIDI溶解转到磁珠沉淀、水溶解的时候，由于BigDye、反应体系的差异，加上磁珠沉淀纯化的效率比乙醇高，虽然洗脱的时候已经由原来的10μl HIDI转为25~30μl的去离子水，理论上浓度至少降低一半，如果遇着片段比较短，偶尔还是会出现。
10、剩余带磁珠的样品板冰箱冷冻保存，即留了一份备份。
