高GC含量的基因组扩增及其Sanger测序解决方案实例
随着基因检测的普及，对于基因组中涉及到高GC含量的扩增及其Sanger测序成为越来越多人遇到的棘手问题。本文通过实例分析高GC的解决方案。
实施案例1：检测人FOXC1基因中的rs545470261；rs572346201两个SNP位点。
1、DNA模板模板制备。用GenoSton公司的试剂盒D801202提取人的200μl 血液DNA，得到浓度为55.1ng/µl 的DNA，共计65μl。OD260/280比值为1.94，OD260/230的比值为2.1。
2、引物设计。用rs545470261；rs572346201两个SNP上下游各200bp序列为模板，以Oligo7.0 软件设计引物，产物扩增大小及其GC含量具体如下：
3、PCR反应。PCR扩增体系见下表：
Note: 2 X GC Buffer I【货号：S601701】
4、PCR扩增程序。使用ABI9700 PCR仪进行PCR反应，反应程序为：
（1）程序1:
95℃热启动5min，1个循环；
94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，,9个循环；
72℃延伸7 min，16℃ 结束PCR反应；
（2）程序2:
95℃热启动5min，1个循环；
94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸60s，,5个循环；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸60s，,5个循环；
94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，,9个循环；72℃延伸7 min，16℃ 结束PCR反应；
5、结果检测。反应结束后，取5μl 反应产物，2% 琼脂糖凝胶电泳检测，见图1、2。
6、 测序结果。剩余反应产物用来测序，测序结果位点附件序列见图3、图4；
实施案例2：检测人notch3基因中的外显子33、外显子10部分片段。
1、DNA模板模板制备。用GenoSton公司的试剂盒D801202提取人的200μl 血液DNA，得到浓度为55.1ng/µl 的DNA，共计65μl。OD260/280比值为1.94，OD260/230的比值为2.1。
2、引物设计。用notch3基因的全序列为模板，以Oligo7.0 软件设计引物，产物扩增大小及其GC含量具体如下：
3、PCR反应。PCR扩增体系见下表：
Note: 2 X GC Buffer II【货号：S601702】
4、PCR扩增程序
使用ABI9700 PCR仪进行PCR反应，反应程序为：
（1）程序1:
95℃热启动5min，1个循环；
94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，,9个循环；
72℃延伸7 min，16℃ 结束PCR反应；
（2）程序2:
95℃热启动5min，1个循环；
94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸60s，,5个循环；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸60s，,5个循环；
94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，,9个循环；72℃延伸7 min，16℃ 结束PCR反应；
5、结果检测。反应结束后，取5μl 反应产物，2% 琼脂糖凝胶电泳检测，见图1、2。
实施案例3：检测人APOE基因中的rs7412、rs429358 SNP位点；PLEC基因中的部分序列、PLCB3基因组的部分序列、OBSCN基因中的rs199726272 SNP位点。
1、DNA模板模板制备。用GenoSton公司的试剂盒D801202提取人的200μl 血液DNA，得到浓度为55.1ng/µl 的DNA，共计65μl。OD260/280比值为1.94，OD260/230的比值为2.1。
2、引物设计。根据案例3中所述的基因全序列模板，以Oligo7.0 软件设计引物，产物扩增大小及其GC含量具体如下：
3、PCR反应。PCR扩增体系见下表：
Note: 2 X GC Buffer I【货号：S601701】
4、PCR扩增程序
使用ABI9700 PCR仪进行PCR反应，反应程序为：
（1）程序1:
95℃热启动5min，1个循环；
94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，,9个循环；
72℃延伸7 min，16℃ 结束PCR反应；
（2）程序2:
95℃热启动5min，1个循环；
94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸60s，,5个循环；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸60s，,5个循环；
94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，,10个循环；
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，,9个循环；72℃延伸7 min，16℃ 结束PCR反应；
5、结果检测。反应结束后，取5μl 反应产物，2% 琼脂糖凝胶电泳检测，见图1、2。
